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来自非洲的高分辨率冷冻EM图像为工业定制硝化酶铺平了道路

2019-11-13 11:52:13

来自开普敦的一个团队最近发布了第一张高分辨率冷冻电子显微镜(EM)论文,该论文起源于非洲。正如《自然通讯生物学》中所述,该团队将腈水解酶的结构解析为接近原子的分辨率,并利用结构上的见识设计了一种可以在生物技术中进行微调的突变型酶。这项工作是通过一项由“非洲同步加速器技术研究与技术项目”资助的访问计划得以实现的,该项目是一项合作赠款,旨在在非洲和英国的世界领先科学家之间建立合作关系,共同致力于使用同步加速器科学进行研究。

亚硝酸盐是一类引人入胜的植物酶,在合成多种重要化学物质中起着重要作用。这些酶通常对少量底物具有特异性,但它们具有巨大的生物技术潜力。来自开普敦大学的一组科学家着手通过在电子生物成像中心(eBIC)上使用cryo-EM研究酶的结构来实现这一潜力。

在成功地获得高质量的结构信息后,研究小组获得了从卷心菜家族获得的腈水解酶的接近原子分辨率的图像(3.4Å)。利用这种结构,研究小组半理性地设计了一种新的突变型腈水解酶,该酶作用于不受其他天然存在的腈水解酶催化的底物。

该团队希望他们能够为工业所需的任何底物(无论是药物,精细化学品甚至是食品)制造“设计师”腈水解酶。计划在eBIC开展更多工作,以继续这项卓有成效的研究。

螺旋扭曲

腈水解酶是一类用于生产羧酸,氨和酰胺的酶,用于大规模合成药物和工业上重要的化学物质。来自开普敦大学的一组科学家对这些酶着迷,并想研究它们如何进化以及如何关联其结构和功能。

该小组最初比较了来自拟南芥(甘蓝家族的一员)的两种不同的腈水解酶,发现其中一种具有广泛的底物,而另一种对少数底物更具特异性。他们对酶的结合口袋进行了一系列突变,发现改变单个氨基酸会改变腈水解酶的底物偏好。有了这些诱人的知识,该小组决定获取详细的结构信息,以揭示硝化酶如何挑选其底物。

开普敦大学医学生物化学讲师,这项研究的首席研究员Jeremy Woodward博士解释了他的研究小组的动机,

“为了弄清楚到底发生了什么,我们在开普敦大学使用低分辨率的冷冻-EM对所有酶进行了成像,发现它们形成了细丝,其螺旋扭曲的紧密度与底物的大小有关。在事实上,我们发现的氨基酸位于两个螺旋亚基之间的界面上,我们已经观察到了与大量腈水解酶之间的这种相关性,但是直到我们最近一次访问eBIC之前,都无法解释分子水平的变化。钻石光源。”

接近原子的结构

该团队以前使用负染色电子显微镜(EM),其分辨率限制为20Å,并且其高度不足以看到结构中的原子细节。此外,其他实验室的先前工作表明,硝化酶无法结晶,因此cryo-EM是他们的唯一选择。

“这是唯一可以用来回答他们所遇到问题的方法,” eBIC的博士后研究助理Adriana Klyszejko博士解释说。“在Diamond,我们创建的是对用户社区的综合努力,他们可以进一步推动他们的研究。”

在eBIC,团队获得了分辨率为3.4Å的结构。伍德沃德博士阐述:

“我们获得的高质量数据使我们首次能够以接近原子的分辨率观察完整的腈水解酶螺旋丝的结构。我们观察到一个环,该环被我们发现的氨基酸保持在适当的位置,限制了结合的基材的最大尺寸,并随着螺旋扭曲而移动。”

START补助金

这项工作是通过非洲研究和技术用同步加速器技术(START)获得资助的;该倡议于2019年3月成立,旨在建立非洲和英国科学家之间的伙伴关系。START由UKRI科技设施理事会(STFC)从全球挑战研究基金(GCRF)拨款370万英镑资助。STFC获得了GCRF的资助,这是一个为期5年的15亿英镑基金,是实施英国援助战略的关键组成部分,确保英国研究在解决发展中国家面临的问题方面发挥主导作用,包括研究和开发。革新。

START的动机来自非洲社区面临的社会挑战;例如,撒哈拉以南非洲地区有6亿人(70%)没电,可靠的电力供应是使人们摆脱贫困并摆脱对援助的依赖的最有力工具之一。START研究人员将研究能源材料,包括太阳能电池结构,催化剂和电池。由于缺乏对诸如疟疾或艾滋病毒等疾病原因的基本了解,阻碍了非洲医疗保健的发展。结构生物学对此类疾病的背后机制提供了前所未有的见识。

该赠款不仅为来自南非的科学家提供了在eBIC上使用世界一流设施的机会,还为博士后科学家Andani Mulelu博士(该研究的首席研究员)提供了支持。伍德沃德博士解释说:“没有这项工作,就不可能进行这项工作,因为在非洲没有成功进行该实验所需的设备,支持和基础设施。”

Diamond VMXm光束线的首席光束线科学家,START项目的生命科学首席研究员Gwyndaf Evans博士评论道:

“ START倡议的主要目标是帮助非洲建立结构生物学的专业知识和能力。最初,我们通过在南非和钻石本地的重点培训课程,着重于促进使用Diamond的结构生物学设施。最终目的是向非洲资助机构展示结构生物学在解决非洲人类健康和农业问题方面的力量和好处,从而使结构生物学成为该大陆的可持续活动,看到像杰里米·伍德沃德这样的专家在南非担任终身职位,预示着未来,并为建立这种可持续性提供了一些途径。”

设计师硝化酶

利用从高分辨率cryo-EM结构获得的见解,该团队筛选了5,000多个突变体,以设计出一种具有改变后的螺旋扭曲的新酶,该酶作用于不受任何其他植物硝化酶催化的一组新底物上。这是通过识别“热点”氨基酸进行定向进化并通过将细菌的存活与底物文库的成功转化耦合来选择它们来进行的。

研究小组希望在这项工作的基础上,对硝化酶进行微调,以充分发挥其生物技术的潜力。“我们希望可以通过适当改变螺旋扭曲度和结合口袋来为任何底物生产'设计'腈水解酶,为此,我们希望将一系列关键的腈水解酶可视化。高分辨率冷冻电磁法检测到一系列不同的螺旋状态(和底物特异性),”伍德沃德教授总结道。

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